CASE1：

为明确某新化妆品对皮肤有无损害作用，将12只大白兔的左背部涂抹该化妆品，右侧涂生理盐水作为对照，?2小时后观察皮肤反应。这属于什么对照?  

解答：此为“自身对照”。    ，

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CASE2：

琴纳用牛痘疫苗接种23人后再接种天花，结果无人患天花，而当时一般人接触天花病人后，天花的发病率约90％。琴纳所用的属于什么对照?   

解答：此为“标准对照”。

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CASE3：

将20只小白鼠分为实验组和对照组，实验人员闲着眼睛用手去鼠笼中随机抓小鼠，抓出10只小鼠作为实验组，剩余10只作为对照组。由于实验人员是闭着眼睛用手随机抓，故该分组为随机分组。你认为是否正确?为什么?

解答：

不正确。随机不等于随便，随机的意思在这里是指每只动物都有相同机会进入实验组或对照组，而目前的方法由于动物活跃程度不相同，进入各组的机会就不同，活跃度低的动物进入实验组的机会就会增大，因此破坏了随机化原则。

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CASE4：

某医院为观察某新药治疗急性支气管炎的疗效，用氨苄青霉素作对照。病人入院时，体温在39℃以下分在治疗组，体温在39℃及以上分在对照组。结果新药疗效优于氨苄青霉素。你认为是否正确?为什么?

解答：

不正确。体温为感染的一个重要指征，体温不同可以反映感染的程度不同，目前分组方法将体温低的分在试验组，而将体温高的分在了对照组，显然使两组不具有可比性，其结果也就不可信，它高估了试验药的疗效。

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CASE5：

试将同性别、体重相近的30只动物分到A、B、C三组。

方法：先将动物按体重编号，再从本书后面所附随机数字表中任一行如第16行最左开始连续取30个两位数字。最后将这30个两位数字分别除以3，余数0、1、2分别对应于A、B、C三组。

  30只动物完全随机分组的结果

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
随机数	88	56	53	27	59	33	35	72	67	47	77	34	55	45	70
余数	1	2	2	0	2	0	2	0	1	2	2	1	1	0	1
分组	B	C	C	A	C	A	C	A	B	C	C	B	B	A	B
编号	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
随机数	08	18	27	38	90	16	95	86	70	75	09	72	95	84	29
余数	2	0	0	2	0	1	2	2	l	0	0	0	2	0	2
分组	C	A	A	C	A	B	C	C	B	A	A	A	C	A	C

结果第4，6，8，14，17，18，20，25，26，27，29号共11只动物分到A组；第1，9，12，13，15，21，24号共7只动物分到B组；第2，3，5，7，10，11，16，19，22，23，28，30号共12只动物分到C组。

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CASE6：

例8-2  为比较四种抗癌药物(A，B，C，D)的疗效，将小白鼠体重作为分层或区组因素，试分配处理。

方法如下：

从书后的随机数字表中任取两列(如第9和第10列)，得两位随机数字(同一区组如遇两个相同随机数则舍去后一个)填于表8-2中，然后分别对每一区组中随机数字按大小顺序排列，其序号1，2，3，4分别对应于四种抗癌药物A，B，C，D。

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CASE7：   

为比较A、B两种减肥药对肥胖病人的减肥效果，将60名肥胖患者按性别相同、体重相近配成30对。每对患者随机分配入A、B两药组，30天后比较A、B两组患者体重的下降值(kg)。

    (1)该实验属何种设计方案?

    (2)变量或资料(体重下降值)属何种类型?

    (3)其结果可用何种统计分析方法进行分析?

解答：

(1)配对设计；

(2)计量资料；

(3)可根据资料的特点选用配对t检验，或随机区组设计资料的方差分析。

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CASE8：

**某医生欲比较某饮食疗法与一种药物疗法对降低血清胆固醇含量的疗效，选择了40名高脂血症病人。设立了4个组：正常饮食组；饮食疗法组；药物组；药物+饮食疗法组。请问最好采用何种试验设计方案，并简述其理由。

解答：

本试验其目的在于比较某饮食疗法与某药物疗法对降低血清胆固醇含量的疗效，最好采用2X2析因设计。因为设立的4个组中，正常饮食组相当于既无饮食疗法又无药物疗法的情形；饮食疗法组相当于仅有饮食疗法而无药物疗法的情形；药物组相当于仅有药物疗法而无饮食疗法的情形；药物+饮食疗法组则是既有药物疗法也有饮食疗法的情形。尽管题中未提及是否考虑饮食疗法和药物疗法的交互效应，但根据专业考虑饮食疗法和药物疗法的相互影响是必要的。

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CASE9：

为研究膳食中添加赖氨酸盐后对正常儿童生长发育有无影响，拟在面包中添加L-赖氨酸盐后用幼儿园的学生进行干预试验。问

    (1)可采用何种设计方案?

    (2)如何设置对照?

    (3)观察指标有哪些?

    (4)需控制哪些非处理因素?如何控制?

解答：

(1)可采用完全随机设计；

(2)应选择实验对照，即实验组食用添加赖氨酸盐的面包，对照组食用普通面包。

(3)观察指标应选择灵敏、客观地反映生长发育的指标，比如身高、体重、头围、智商等指标。

(4)需要控制的非处理因素比如年龄、性别、疾病、家庭经济状况等一般指标，以及一些主观因素对结果的影响。为控制这些因素，在设计时，应明确纳入、排除标准，采用分层抽样方法进行抽样，自始至终贯彻随机化原则，同时可使用盲法观察。

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CASE10：

为进行对苯二甲酸、乙二醇联合作用对肾脏损伤的实验研究，将48只SD大鼠随机分为到对苯二甲酸组、乙二醇组、苯二甲酸+乙二醇和生理盐水组，每组12只。

    (1)你认为最好选用哪种试验设计方案?并说明理由。

    (2)如果研究的目的为比较苯二甲酸、乙二醇对肾脏是否有损伤，损伤是否有差异，又该选用何种设计方案？

解答：

(1)本试验目的在于评价对苯二甲酸、乙二醇联合作用对肾脏损伤，所以宜选用2X2析因设计，因为在常用的设计方法中，析因设计不仅能比较组间的效应和交互效应，同时也节约样本。

(2)如果仅在于比较对苯二甲酸、乙二醇对肾脏是否有损伤，损伤是否有差异，则可采用完全随机设计，或者随机区组设计，可不设苯二甲酸+乙二醇组。

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CASE11：

例9—2  为探索丹参对肢体缺血再灌注损伤的影响，将30只纯种新西兰实验用大白兔，按窝别相同、体重相近划分为10个区组。每个区组3只大白兔随机采用A、B、C三种处理方案，即在松止血带前分别给予丹参2ml/kg、丹参1ml/kg、生理盐水2ml/kg，在松止血带前及松后1小时分别测定血中白蛋白含量(g/L)，算出白蛋白减少量如下表9—6所示，问A、B两方案分别与C方案的处理效果是否不同?

从该例可以看出，随机区组设计将数据按区组和处理组两个方向进行分组，在b个区组和k个处理组构成的bk(=N)个格子中，每个格子仅有一个数据。

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　中国十大服装品牌

　　杉杉(中国驰名商标)

　　波司登(中国驰名商标)

　　红豆(中国名牌)

　　罗蒙(中国驰名商标)

　　报喜鸟(中国驰名商标)

　　雅戈尔(中国驰名商标)

　　鄂尔多斯(中国驰名商标)

　　庄吉(中国驰名商标)

　　阳光(中国驰名商标)

　　柒牌(中国驰名商标

　　西服类：

　　1新郎西服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2杉杉西服(中国驰名商标,中国名牌)

　　3罗蒙西服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4雅戈尔西服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　5报喜鸟西服(中国驰名商标,中国名牌)

　　6红领西服(中国驰名商标)

　　7红豆西服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　8庄吉(中国驰名商标,中国名牌)

　　9法派西服(中国驰名商标,中国名牌)

　　10培罗蒙(中国驰名商标)

　　羽绒服：

　　1波司登羽绒服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2艾莱依羽绒服Eral(中国名牌,世界品牌)

　　3雅鹿羽绒服(中国名牌,国家免检产品)

　　4鸭宝宝羽绒服(知名畅销品牌)

　　5鸭鸭羽绒服(中国驰名商标,国家免检产品)

　　6雪中飞羽绒服(中国名牌,国家免检产品)

　　7冰洁羽绒服(波司登集团品牌)

　　8雪驰羽绒服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　9红豆羽绒服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　10雪伦羽绒服(知名畅销品牌)

　　休闲服：

　　1森马休闲服(中国驰名商标,中国名牌)

　　2唐狮休闲服(中国驰名商标)

　　3李宁运动服(知名畅销品牌)

　　4耐克运动服(世界畅销品牌)

　　5阿迪达斯运动服(世界畅销品牌)

　　6以纯休闲服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　7佐丹奴休闲服(国家免检产品)

　　8依米奴休闲服(国家免检产品)

　　9美特斯邦威休闲服(中国驰名商标,国家免检产品)

　　10乔丹运动服(中国驰名商标)

　　女装：

　　1哥弟女装(中国驰名商标,台湾名牌)

　　2only女装(世界品牌,丹麦名牌)

　　3艾格女装(法国ETAM集团分支企业,著名畅销品牌)

　　4歌莉娅女装(中国女装/秋装/夏装高知度品牌)

　　5太平鸟女装(中国女装高知度品牌)

　　6虫虫女装(香港名牌,知名畅销品牌)

　　7红袖女装Hopeshow(中国女装高知度品牌)

　　8太和女装(中国女装高知度品牌)

　　9斯尔丽女装(中国驰名商标,国家免检产品)

　　10千百惠女装(中国知名畅销品牌)

　　中国十大女装品牌榜中榜/十大名牌女装

　　1哥弟女装(中国驰名商标,台湾名牌)

　　2only女装(世界品牌,丹麦名牌)

　　3艾格女装(法国ETAM集团分支企业,著名畅销品牌)

　　4歌莉娅女装(中国女装/秋装/夏装高知度品牌)

　　5太平鸟女装(中国女装高知度品牌)

　　6虫虫女装(香港名牌,知名畅销品牌)

　　7红袖女装Hopeshow(中国女装高知度品牌)

　　8太和女装(中国女装高知度品牌)

　　9斯尔丽女装(中国驰名商标,国家免检产品)

　　10千百惠女装(中国知名畅销品牌)

　　世界十大女装品牌榜中榜

　　1GabrielleChanel夏奈尔

　　2ChristianDior克里斯丁迪奥

　　3Givenchy纪梵喜

　　4YvesSaintLaurent伊夫圣洛朗

　　5Valentino瓦伦蒂诺

　　6Versace范思哲

　　7GiorgioArmani乔治阿玛尼

　　8LsseyMiyake三宅一生

　　9Kenzo高田贤三

　　10CalvinKlein卡尔文克莱恩

　　11DonnaKaran唐娜卡伦

　　12FLRS法涵诗

　　2007世界十大时装品牌榜中榜

　　1夏奈尔Chane(1913年法国巴黎)

　　2路易·威登LouisVuitton(LV品牌创立于1854年法国巴黎)

　　3迪奥Dior(Christiandior开始于1946年法国巴黎)

　　4范思哲Versace(1978年意大利米兰)

　　5Prada(创于20世纪初意大利米兰)

　　6卡尔文·克莱恩(Calvinklein)(1968年美国纽约)

　　7高田贤三Kenzo(日本人1970创于法国)

　　8古奇欧·古孜Gucci(1923年意大利佛罗伦萨)

　　9华伦天奴Valentino(意大利人Valentino1960创于罗马)

　　10切瑞蒂(Cerruti)(1967年法国巴黎)

　　中国十大男装品牌榜中榜/十大名牌男装

　　1劲霸男装(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2柒牌男装(中国驰名商标,中国名牌)

　　3七匹狼男装(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4利郎男装(中国名牌,国家免检产品)

　　5才子男装(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　6太子龙男装(中国驰名商标,知名品牌)

　　7九牧王男装(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　8虎都男装(中国驰名商标,中国名牌)

　　9帝牌男装(中国驰名商标,国家免检产品)

　　10Boss男装(世界品牌,中国驰名商标)

　　世界十大男装品牌榜中榜

　　1HugoBoss波士

　　2GianfrancoFerre乔治·阿曼尼

　　3CalvinKlein卡尔文·克莱恩

　　4古奇欧·古孜Gucci

　　5Dolce&Gabbana多尔切和加巴那

　　6Prada普拉达

　　7ChristianDior里司汀·迪奥

　　8DommaKaran（美国品牌）

　　9GiorgioArmani（意大利品牌）

　　10Zegna杰尼亚

　　十大牛仔裤品牌榜中榜/名牌牛仔裤

　　1李维斯Levi's牛仔裤(品牌开始于1853美国,牛仔裤的“鼻祖”)

　　2Lee牛仔裤(开始于1889年美国,百年历史)

　　3CK牛仔裤(卡文克莱)(CalvinKlein牛仔裤开始于1968年美国)

　　4苹果Texwood牛仔裤(香港德士活集团的旗舰品牌,牛仔裤专家)

　　5兰雁牛仔裤(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　6旗牌王KIPONE牛仔裤(香港旗牌王集团品牌,国家免检产品)

　　7黑牡丹牛仔裤(中国驰名商标,中国名牌)

　　8Only牛仔裤(欧洲莱卡与丹麦著名品牌)

　　9第五街牛仔裤(第五街5thSTREETJEANS始于1965年美国)

　　10Wrangler牛仔裤(美国西部的品牌,世界知名品牌)

　　中国十大服装品牌榜中榜/十大名牌服饰

　　1森马服饰(中国驰名商标,中国名牌)

　　2雅戈尔YOUNGOR(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　3以纯服饰(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4新郎(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　5杉杉(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　6南极人(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　7波司登(中国驰名商标)

　　8鄂尔多斯(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　9报喜鸟(中国驰名商标,中国名牌)

　　10红豆(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2007世界十大服装品牌榜中榜

　　1夏奈尔(Chanel)(1913年法国巴黎)

　　2路易·威登LouisVuitton(LV品牌创立于1854年法国巴黎)

　　3迪奥Dior(Christiandior开始于1946年法国巴黎)

　　4范思哲Versace(1978年意大利米兰)

　　5Prada(创于20世纪初意大利米兰)

　　6卡尔文·克莱恩(Calvinklein)(1968年美国纽约)

　　7高田贤三Kenzo(日本人1970创于法国)

　　8古奇欧·古孜Gucci(1923年意大利佛罗伦萨)

　　9华伦天奴Valentino(意大利人Valentino1960创于罗马)

　　10切瑞蒂(Cerruti)(1967年法国巴黎)

　　中国十大领带品牌榜中榜/名牌领带

　　1巴贝BABEI(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2麦地郎(中国名牌,国家免检产品)

　　3雅戈尔(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4俊仕Gent*S(国家免检产品)

　　5金利来领带(中国驰名商标,知名品牌)

　　6古琦欧·古琦Gucci(开始于1923年意大利佛罗伦萨)

　　7登喜路Dunhill(创立于1893年英国伦敦)

　　8巴宝莉Burberry(1856年在英格兰开始第一家品牌户外服饰店)

　　9鳄鱼Lacoste(开始于1933年法国)

　　10波士HugoBoss(1923年创立于德国,著名男装品牌)

　　中国十大衬衫品牌榜中榜/中国名牌衬衫

　　1雅戈尔YOUNGOR(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2海螺(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　3开开(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4步森(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　5才子衬衫(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　6绅士衬衫(中国名牌,国家免检产品)

　　7罗蒙(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　8虎豹HUBAO(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　9红豆(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　10洛兹(中国名牌,国家免检产品)

　　中国十大冬装品牌榜中榜/名牌冬装榜中榜

　　1波司登羽绒服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　2鄂尔多斯羊毛衫(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　3鸭宝宝羽绒服(知名畅销品牌)

　　4恒源祥羊毛衫(中国名牌)

　　5鸭鸭羽绒服(中国驰名商标,国家免检产品)

　　6鹿王羊绒衫(国家免检产品)

　　7凯撒皮衣(中国驰名商标,中国名牌)

　　8珍贝羊绒衫(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　9雪驰羽绒服(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　10美特斯邦威羊毛衫(中国驰名商标,中国名牌)

　　中国十大夏装品牌榜中榜/十大名牌夏装

　　1歌莉娅(中国秋装/女装高知度品牌)

　　2艾格(法国ETAM集团分支企业,著名畅销品牌)

　　3美特斯邦威(中国驰名商标,中国名牌)

　　4阿依莲Ayilian(高知名秋装/女装品牌)

　　5ONLY(世界品牌,丹麦名牌)

　　6以纯(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　7佐丹奴休闲服(国家免检产品)

　　8真维斯JEANSWEST(高知名度品牌)

　　9范思哲Versace(意大利品牌，世界十大服装品牌)

　　10斯尔丽(中国驰名商标,国家免检产品)

　　中国十大秋装品牌榜中榜/十大名牌秋装

　　1美特斯邦威Metersbonwe(中国驰名商标,中国名牌)

　　2阿依莲Ayilian(高知名秋装/女装品牌)

　　3以纯(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　4艾格(法国ETAM集团分支企业,著名畅销品牌)

　　5瑞丽(知名品牌)

　　6耐克nike(世界品牌)

　　7真维斯JEANSWEST(高知名度品牌)

　　8only(世界品牌,丹麦名牌)

　　9阿迪达斯adidas(世界品牌)

　　10歌莉娅秋装(中国女装/秋装/夏装高知度品牌)

　　中国十大内衣品牌榜中榜/名牌内衣榜中榜

　　1黛安芬(世界专业内衣品牌，120年历史)

　　2南极人内衣(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　3曼妮芬(世界专业内衣品牌

　　4婷美内衣(畅销知名品牌)

　　5古今内衣(中国名牌)

　　6北极绒内衣(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　7三枪内衣(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　8安莉芳内衣(国家免检产品)

　　9AB内衣(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　10暖倍儿内衣(国家免检产品)

　　中国十大名牌童装榜中榜/十大童装品牌

　　1贝蕾尔童装(韩国名牌,专业的儿童服装品牌)

　　2叮当猫童装(名牌儿童服装)

　　3娃哈哈童装(高知名度品牌)

　　4米奇妙(世界知名童装品牌)

　　5abc童装(台湾名牌,专业品牌)

　　6小数点童装(消费者喜爱品牌)

　　7小猪班纳童装(国际知名童装品牌)

　　8织里童装(中国驰名商标,中国名牌,国家免检产品)

　　9jojo童装(知名品牌)

　　10好孩子童装(知名品牌

无菌操作基本技术

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程 中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐 针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：

5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力

5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

实验用品

1. 种类︰

1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。

1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml

1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。

1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml

2. 清洗︰

2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。

2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

3. 灭菌︰

3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。

3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。

3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。

培养基

1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。

2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：

3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合， 然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生 长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。

3.2. 材料：

3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

3.2.2. 粉末培养基

3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)

3.2.4. 电磁搅拌器

3.2.5. 无菌血清瓶

3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜

3.2.7. pH meter

3.2.8. 真空帮浦

3.2.9. CO2 气体

3.3. 步骤：

3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。

3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后 溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时， pH 会升高0.1-0.2。

3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4. 配制培养基之生长测试

4.1. 材料：

4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)

4.1.3. methanol

4.1.4. glacial acetic acid

4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步骤：

4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群 落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。

4.2.4. 去除固定液，水洗二次。

4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。

4.2.6. 去除染液，水洗二次。

4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。

抗生素

1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素

1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml)。

3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。

4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin

250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

5. 抗生素使用种类与浓度：

               工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌

penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria

streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria

chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria

gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma

amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds

nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds

fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds

血清

1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 oC 直接至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。

5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较

不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6. 血清之沈淀物

6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会 阻塞过滤膜。

6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。 有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清 放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更 会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批 号的血清。

7. 血清之生长测试

7.1. 材料：

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )

7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)

7.1.4. methanol

7.1.5. glacial acetic acid

7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)

7.2. 步骤：

7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80 % confluency。

7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活 细胞数/ ml。

7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血 清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。

7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。

7.2.8. 去除染液，水洗二次。

7.2.9. 以肉眼计数群落数

7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：

SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %

7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %

7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。

7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于–70 oC 保存之

冷冻细胞活化

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死 亡。

2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生 单株抗体或是其它蛋白质)。

3. 材料

3.1 37 oC 恒温水槽

3.2 新鲜培养基

3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶

3.4 液氮或干冰容器

4. 步骤：

4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无 菌操作台内。

4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。

4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞 悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。

4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

 细胞传代培养

1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞

种类而异。

2. 材料：

2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,

GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽

回温。

1.如何选用培养基？

    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养">细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养">细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。

2.为什么要热灭活血清？

    加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

    L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

    GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。

    GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红？

    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？

    用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染？

    当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

    高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。

5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6)重复步骤4。

7)在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

    HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌体检验

生物化学检测

激素的检测

血红蛋白检测

Sf9 细胞生长促进及方法学检测

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？

    二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？

    是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中

摘要：激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope , LSCM)是近十年随光学和计算机等技术的发展而发展起来的医学图像分析仪器,现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图像分析、单细胞的三维结构以及其表面的分子和离子成像和观测、进行活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。它除了光学显微镜部分,主要还有激光光源、扫描装置和共聚焦系统。其性能为普通光学显微镜质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜细胞生物学

1        激光扫描共聚焦显微镜[1]

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope , LSCM)在普通光学显微镜的基础上对成像原理作了改进,该系统主要包括激光光源、自动显微镜、扫描模块(包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器) 、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备(显示器、彩色打印机) 等。LSCM 用单色激光作光源,用光源针孔所作的小孔光阑形成点光源,在检测器前有一个检测针孔,光点通过一系列透镜同时聚焦于光源针孔和检测针孔,即“共聚焦”系统.这不仅排除了焦点以外的光信号干扰, 同时利用计算机的图像处理技术,把光学成像的分辨率提高了30-40 %，而且能无损观测光学切片,实时检测活体单细胞的信号,对单细胞进行荧光强度定量[2] 、表面分子定位分析[3] 以及实时定量测定单细胞内的Ca2 + [4、5] 、pH 等。LSCM是光学显微镜发展历史上的重大突破。与传统的光学显微镜相比,它能产生真正具有三维清晰度的图像。

生物用共聚焦显微镜大多是在荧光显微镜成像的基础上,以紫外线可见激光激发荧光物质,得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。不同的结构有各自性的荧光染料,有些甚至可以在活细胞上非创伤性地进行染色,在亚细胞水平上观察诸如Ca 2 +、pH 、膜电位等生理信号及细胞形态的动态变化,特别是在结合了先进的生物学技术以后,更成为药理学、形态学、细胞生物学、神经科学研究中强有力的新一代研究工具。

1.1 激光扫描共聚焦显微镜的成像原理[6]

LSCM是由普通荧光显微镜和共聚焦系统组成。它采用激光作为点光源(point light source)照射标本,在焦平面上形成了一个轮廓分明的微米级的光点(light spot ) （该点正置显微镜物镜焦点所在），被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器( beam  splitter)。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔(pinhole) ,分别称为照明针孔和探测针孔。二者的几何尺寸一致,约0.1 ～0.2 μm ;相对于焦平面上的光点。二者是共轭的,即:光点通过一系列的透镜最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这正是“共聚焦”含义之所在。（如图1）

这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测针孔范围之内,而其它来自焦平面上方或下方的散射光,都被挡在探测针孔之外而不能成象。以激光逐点扫描样品,探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,转为为数字量传输至计算机, 并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。因此通过激光扫描共聚焦显微镜,可以对观察样品进行断层扫描和成像。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横断面[7]。激光扫描共聚焦显微镜现已成为活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。

经过技术改进，在激光扫描共聚焦显微镜系统中安装一个微动步进马达(最小步距可达0.1μm)来控制载物台的升降,使焦平面依次位于标本的不同层面上，则可逐层获得物体光学横断面的图像,这称为“光学切片”( Optical sectioning)。获得真正意义上的标本的三维数据,可以利用多种计算机图像处理及三维重建软件,沿x 、y 、z 轴或其它任意角度来表现标本的外形剖面,十分灵活、直观进行形态学观察。

1.2 LSCM与普通显微镜的区别

1.2.1 光源

普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。

1.2.2 空间分辨率

普通显微镜摄影是场摄影, 同时包含了焦点和非焦点的影像, 必然受到物镜分辨率和切片厚度的制约。而LSCM 对标本上的每个点都是在焦点上的摄影, 其在X- Y 轴上的最佳空间分辨率可达0.2~0.25μm, 较普通显微镜要高出40%[8];在Z 轴上的最佳空间分辨率可达0.5~0.6μm[9]。

1.2.3 瞬时分辨率[10]

LSCM 较普通显微镜的另一大优点是可以实时动态观察活体组织标本。LSCM 的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光, 即其时间分辨率极高, 能对细胞内的分子进行功能性动态观察; 检测灵敏性极强; 还可对荧光进行精确定量

1.2.4 图像处理

LSCM 的图像是以电信号的形式记录下来的, 可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图像处理。另外, LSCM 图像分析软件系统功能强大, 可对图像进行三维重建分析, 获得时空上大量多样信息, 而普通显微镜则是望尘莫及的。

2  激光扫描共聚焦显微在细胞生物学中的应用

在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性: ①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。②细胞内离子荧光标记,单标记或多标记,检测细胞内如pH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。③荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体,核酸等观察;可以在同一张样品上进行同时多重物质标记,同时观察; ④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性;数据图像可及时输出或长期储存。

激光共聚焦显微镜适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。

2.1 荧光定量定位分析[11]

经典的形态学手段如普通光学显微镜、相差显微镜及电子显微镜,仅能对肿瘤相关抗原进行定性分析,而LSCM则可对活细胞进行重复性极佳的荧光定量分析。LSCM采用定量免疫荧光对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征、抗肿瘤药物的作用及机制等方面进行定量的观察和监测,当然也是较为理想的形态学观察方法。LSCM已广泛用于癌的研究,近年来逐渐在肉瘤中得到应用。Bcl-2 作为凋亡抑制因子是年来的研究热点,但在普通光学显微镜下观察仅能显示其定位于胞浆,且只能进行定性或半定量分析,而有人用荧光标记的方法,利用LSCM 研究bcl-2 在滑膜肉瘤中的表达,对其进行了定量分析,并与正常滑膜细胞作比较,发现bcl-2 在滑膜肉瘤中的含量显著高于正常对照组,提示bcl-2 的过度表达在肉瘤的发生上起着异常重要的作用。更为重要的是其准确的亚细胞定位有利于进一步研究bcl-2 的致癌机制,并为今后基因治疗的准确定位提供了理论基础。

2.2　Ca2 + 、pH 及其他细胞内离子浓度及变化的实时定量测定

利用Fluo23 、Fura22 等荧光探针可以测量单个细胞内pH 和多种离子(Ca2 + 、K+ 、Na + 、Mg2 + ) 在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

2.3 三维重建[12]

    利用LSCM能在活体上保持标本不受损害性干扰的情况下 ,对标本作连续的光学切片,将收集到的图象经过计算机软件的分析,作出三维重建的图像,得到较为清晰的立体结构图像。利用LSCM作了正常角膜的三维重建。对角膜伤口收缩期的肌性成纤维细胞中的f -肌动蛋白结构作了三维重建,发现在角膜伤口收缩过程中,肌纤维母细胞中f -肌动蛋白的结构由无序的、随机的细点状结构到有序的、粗束状结构的变化过程。

2.4 胞间通讯研究[13]

动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。A-CAS可用于测定相邻植物或动物细胞之间细胞间通讯,测量由细胞缝隙连接介导的分子转移,研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用,以及胞内Ca2+,pH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。

2.5 粘附细胞的分选( adherent cell sorting)[14]

流式细胞仪可以实现游离细胞的分选,如鉴别出二倍体和多倍体细胞。激光细胞仪则可能对贴附在培养皿底部的粘附细胞进行分选。将细胞贴壁培养在特制培养皿上,培养皿底部有一层特殊的膜,用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状,掀去培养皿底部的膜,非选择细胞则被去除。该分选方式特别适用于选择数量极少的细胞,诸如突变细胞、转化或杂交癌细胞。另一种细胞分选的方式是用高能量激光自动杀灭不需要细胞,留下完整的活细胞亚群继续培养,这种方式适于对数量较多的细胞的选择。

2.6 细胞激光显微外科[15]

可把激光作为一把“光子刀”,实现诸如细胞膜间穿孔、线粒体或溶酶体等细胞器烧灼、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞“外科手术”。

2.7 光镊( Optical tweezer)[6]

光镊是利用激光的力学效应,将一个微米级大小的细胞器或其它结构钳制于激光束的焦平面上,也称为光陷阱(optical trap)。激光从上方进入显微镜的物镜,光束内聚,在焦平面上形成光束狭部( beam waist ) ,产生三维的光强梯度,一个微米级的物体就可被陷阱捕获。显微镜的照明光线来自下方的聚光器。光镊可以用来进行细胞融合(如卵细胞受精)、机械刺激或细胞骨架弹性测量等,特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义〔16〕,因为植物有一层厚硬的细胞壁,不能象动物细胞那样利用微操纵器对原生质膜进行机械处理。

2.8 笼锁化合物( caged compounds)的解笼锁( uncage)[14]

现在许多重要的生物活性物质(神经递质、细胞内第二信使)都有其笼锁化合物合成,如Ca 2 +的笼锁化合物主要有Nitr- 5 ,DM - nitrophen 。在笼锁(caged)状态下,其功能被封闭,一旦被特异波长(一般为紫外)的瞬间照射后,即被光活化而解笼锁( uncaged) ,快速地恢复原有的活性和功能。这种方法提供了一种在时间和空间上可控的生物活性产物或其它化合物释放的有效方法。

2.9 光漂白后的荧光恢复( Fluorescent recovery after photobleaching , FRAP)活细胞的动力学参数[12 .17]

FRAP 技术借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的未淬灭的荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。在研究细胞骨架构成、跨膜大分子迁移率、细胞膜流动性、胞间通讯等领域中有较大的意义。

2.10 长时程观察细胞迁移和生长

目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描,而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高,只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量,从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤,因此,可以用于数小时的长时程定时扫描,记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

3 激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛[18]

3.1细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡;

3.2生物化学:酶、核酸、FISH、受体分析;

3.3药理学:药物对细胞的作用及其动力学;

3.4生理学:膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态;

3.5遗传学和组胚学: 细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断;

3.6神经生物学:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递;

3.7微生物学和寄生虫学:细菌、寄生虫形态结构;

3.8病理学及病理学临床应用:活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断;

3.9生物学、免疫学、环境医学和营养学。

4 展望[1]

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学分析仪器,与传统的光学显微镜相比,大大地提高了分辨率,能得到真正具有三维清晰度的原色图象,并可探测某些低对比度或弱荧光样品,通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+,pH值,Na1+,Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标,对细胞动力学研究有着重要的意义。同时,激光扫描共聚焦显微镜可以处理活的标本,不会对标本造成物理化学特性的破坏,更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普通显微镜上的质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面,在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

参考文献：

[1]陈耀文，林珏龙，赖效莹，梅品超。激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。激光生物学报，1998，7（2）

[2]刘学东, 龚书明, 杨瑞华等. 第四军医大学学报,2000 , 21 (6) : 702

[3]刘运来, 姚忠祥, 蔡文琴  解剖科学进展, 1999 , 5 (4) : 367

[4]林珏龙, 陈耀文  激光生物学报, 1998 , 7(3) : 220

[5]董　明, 徐侃彦, 甄晓光 生物化学与生物物理学报, 2000 , 32 (5) :533

[6]郗昕，姜泗长，方耀云 激光扫描共聚焦显微镜的原理与生物学应用。中国体视学与图像分析。1996，12；7：74-78

[7]张旭，徐维奇。激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用。现代科学仪器。2001，2

[8]Gustafsson MG. Extended resolution fluorescence microscopy. [J].Curr. Opin. Struct. Biol., 1999;9(5): 627

[9]杨天祝,李文镇 共聚焦激光扫描显微镜术简介[J].河北医科大学学报[J].2002;23( 5) : 319

[10]许险峰,霍霞 活细胞钙动态的共聚焦扫描显微镜检测技术[J].激光生物学报.2002;11( 4) : 296

[11]周涛,杨怡,张德添,何昆,张飒 激光扫描共聚焦显微镜及其在生物医学中的应用。军事医学科学院院刊。2002，3；26（1）：69-73

[12]王风翔，何守志  激光扫描共聚焦显微镜在眼科研究中的应用。　中国体视学与图像分析。1998，3

[13]刘畅，顾玲 激光扫描共聚焦显微镜在细胞凋亡研究中的应用。医学综述，2001，7；10

[14] Klauning J E , Ruchi RJ . Role of inhibition of intercellular communication in carcinogenesis. L ab I nvest ,1990 ;62 :135 ～143

[15]Kasten FH. Introduction to fluorescent probes : properties , history and applications. In Mason WT. (ed. ) Fluorescent and luminescent probes of r biological a ctivity ; APractival Guied to Technology for Quantitative real -TimeAnalysis. New York ; Academic Press , 1993 ; 12～33

[16]陈耀文，林珏龙，陈代雄 激光扫描共聚焦显微镜三维重建花粉的组织结构。中国体视学与图像分析，1997，2；4：223-225

[17]Tyler A. Byassee, Warren C. W. Chan, and Shuming Nie。Probing Single Molecules in Single Living Cells。Anal. Chem.2000，72：5606-5611

[18]朱珊珊　黄志江  激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用   国外医学麻醉学与复苏分册　F Med Sci Anesth Resus , April 2005 ,Vol 26 ,No12

聪明的妻子总是会在爱人面前扮演着不同角色。当爱人不开心时，她可以像个大姐姐般地去安慰他，直到他的嘴角露出几许笑容；当爱人生病时，又像母亲一样地把他抱在怀里轻轻拍打他的双肩，并给他煲上一锅好汤，让他暖暖的；不过当她自己有什么委屈时，又会像个小孩子般在爱人面前哭泣，以博取他的呵护和安慰。

1、老公是拿来爱的，不是拿来气的。爱老公就是爱自己。

2、老公想吃苹果时马上就去洗。经验证明推来推去的结果不仅有伤和气而且所消耗的时间和能量已经能洗完苹果了。

 3、点菜时要明确说出想吃什么。免得点完之后谁都不爱吃或者只有一方爱吃事后犯嘀咕。

 4、吵架时绝不说分手或者离婚，免得事后下不了台。要是我错了，吵过之后，看他还死绷着脸我就装可爱，装可怜，装精灵鼠小弟，装蜡笔小新，装樱桃小丸子，总之，就是死皮赖脸地往他身上粘。这招屡试不爽！要是我占理，他错了，我就摆一副后娘脸，再适当赏他一些搭话的机会，GG会十分诚恳地向我道歉，诚恳到我绷不住脸。

 5、尽量不要用食物（特别是水果，拎着又沉）做礼物，免得吃完之后就忘记。

 6、吵架时尽量少发火多流泪。在老婆还是我女朋友的时候，每当她哭，我都会手足无措地干着急。我最怕女人哭了，所以每次她哭，我就马上又是抱又是亲又是哄的，还要扮猴子学小狗，可是结果她还要捏我咬我，说我是多管闲事活该，唉，真是不讲理。

7、一定要记住老公的生日（阳历的和农历的），保证第一个向老公说生日快乐。  

8、养成一见老公就笑的习惯（可以想象和你一起散步时因为他越来越鼓的肚子远远看着让人搞不清哪个是孕妇）。特别是下班回家开门时。  

9、需要老公陪同而老公不能陪同的时候想象自己是保家卫国者的妻子，告诉他：你忙吧，我能行。

10、软磨硬泡的时候注意发挥女性特色。

11、故意在他半睡半醒的时候亲他并帮他盖好被子

12、在他吹嘘自己的时候假装很崇拜他，并表现出对未来幸福生活充满希望的样子。其实，更多的男士钟情于对女人炫耀自己的种种好处，这时只要聆听就好了。因为他只是想让你“崇拜”他一下，记得还要时常给他一个肯定的眼神。

13、在你看电视或碟片看到故事里的婚姻生活很悲惨的时候，想一下你丈夫对你好的时候，不在身边的话就给他打个电话，在身边的话，就趴在他身上哭一会，并且说，我们不要那样好不好？

14、在老公向你献殷勤之后表现出特别兴奋的样子，并且说一句“老公你对我最好了！”以资鼓励。

15、偶尔的用不经意的语气对老公说起诸如某位男同事刚来的时候想请你去喝咖啡，而你却因为想要给你去买件T恤拒绝的事

 16、既然已经选择和他共度人生，就不要幻想改变他，能改变的只有自己。教育是徒劳的，感化是可行的。如果还是不行，在和他闹翻前准备好退路。女人喜欢男人，这八成是错不了的，但女人永远不满意男人，这却是百分之百千真万确的。女人总是希望按照自己的愿望和想象来改造男人，尤其是改造自己的男友(即使成了丈夫也绝不例外)。本来嘛，别的男人跟我有什么关系，而且改造起来总不如自己的男友方便，权当他是个试验品好了。

　17、用他的钱健身买衣服和化妆品。在他眼里至少你在每个年龄段都比上不足比下有余。而这一点只要你愿意修饰是很容易做到的。男人乐意为妻子的美丽买单。其实，真正的好男人，往往都很愿意为自己心爱的女人花钱，因为那是他的一份快乐。在他眼里，女人在花他的钱的时候，显得最可爱，就像是怒放的花朵，分外娇艳，男人为此感到满足，感到自豪，感到自己的价值，感到自己挣钱的意义。

18、在你无聊的时候找些对你有好处的事情做，多花钱也无所谓。切记不要选择和男人聊天，一旦红杏出墙，最好的结果是你常常陷入去与不去约会的两难选择。

19、老公的缺点要一分为二的看。天下没有绝对的缺点与优点。如果他懒惰，那么他就会有更多的休息时间；如果他没钱，那么他会少些出轨的可能；如果他长得难看，就会少些第三者的可能；如果他没有上进心，他会把全部注意力集中在你的身上。千万别以为真的能有那种如同永不磨损型的雷达表一样的男人。不是遇不到，而是真的没有。但这并不是全盘否定“新好男人”的存在。男人，多少总有那么一点点的缺点。找一个缺点也比较可爱的，找一个敢于把自己的缺点和盘托出展现在你面前的，就是最佳的选择。

20、男人在工作学习和思考的时候，不要试着让老公的注意力转移到你身上来。因为他们是为了共同的家奔波劳累，这时唯一能做的是给他宁静的空间，可以去给他快喝干的水杯里加水，或者去熬一锅猪蹄银耳汤，等他干完活，就着窗外的零星灯火喝一碗，他会感觉特别温暖。

山东大学“科学畅想曲”系列学术报告会

报告题目：一个新药分子的旅途

报 告 人：山东大学长江学者特聘教授 闫兵博士

报告人简介：

闫兵博士，山东大学药学院组合化学研究所主任，长江学者特聘教授。1982年1月毕业于山东大学化学系。1990年获美国哥伦比亚大学博士学位。1990年至1993年先后在英国剑桥大学和美国休斯顿德克萨斯微生物和分子基因所进行博士后研究工作。

1993年至1999年受聘于世界著名的Novartis Biomedical Research Institute，先后任助研、研究员和高级研究员，在其Preclinical Pharmaceutical Research Division的核心技术领域从事药物分析和毒性分析的研究工作，最先研发出了组合化学固相高通量合成关键的检测，分析和优化技术，推动了固相合成和组合化学的发展。1999年至2004年，他受聘于美国Discovery Partners International, Inc.任分析化学部门主管，其在组合化学中的合成、纯化和质量控制及用于早期药物开发的高通量筛选领域的研究达到世界领先地位。据不完全统计，闫兵博士在1996年发表在Journal of Organic Chemistry上该领域内的一篇首创性论文被130次引用，7篇该领域的主要论文被引用次数超过500次。1998年，他和其他学术带头人在Anthony Czarnik博士的带领下为美国化学学会创刊发行了Journal of Combinatorial Chemistry (JCC)，并担任两届编委。现任该杂志副主编。2006年在山东大学设立组合化学杂志亚洲分部(JCC Asian Office)。

闫兵博士在分析化学和组合化学分析领域撰写专著4部，参与另外11部书章节或综述文章的编写工作，在Nature, PNAS, Curr.Opin. in Chem.Biol., Acc. Chem. Res., Biochemistry, J. Biol. Chem, Biophys., J. Cancer Res., Anal. Chem.和J. Comb. Chem.杂志上发表论文约70篇，发表论文被他人引用超过1280次。

闫兵教授课题组目前主要从事组合化学、纳米医药及纳米毒理学和新型抗癌药物研发等领域的研究。