摘要：激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope , LSCM)是近十年随光学和计算机等技术的发展而发展起来的医学图像分析仪器,现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图像分析、单细胞的三维结构以及其表面的分子和离子成像和观测、进行活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。它除了光学显微镜部分,主要还有激光光源、扫描装置和共聚焦系统。其性能为普通光学显微镜质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜细胞生物学

1        激光扫描共聚焦显微镜[1]

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope , LSCM)在普通光学显微镜的基础上对成像原理作了改进,该系统主要包括激光光源、自动显微镜、扫描模块(包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器) 、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备(显示器、彩色打印机) 等。LSCM 用单色激光作光源,用光源针孔所作的小孔光阑形成点光源,在检测器前有一个检测针孔,光点通过一系列透镜同时聚焦于光源针孔和检测针孔,即“共聚焦”系统.这不仅排除了焦点以外的光信号干扰, 同时利用计算机的图像处理技术,把光学成像的分辨率提高了30-40 %，而且能无损观测光学切片,实时检测活体单细胞的信号,对单细胞进行荧光强度定量[2] 、表面分子定位分析[3] 以及实时定量测定单细胞内的Ca2 + [4、5] 、pH 等。LSCM是光学显微镜发展历史上的重大突破。与传统的光学显微镜相比,它能产生真正具有三维清晰度的图像。

生物用共聚焦显微镜大多是在荧光显微镜成像的基础上,以紫外线可见激光激发荧光物质,得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。不同的结构有各自性的荧光染料,有些甚至可以在活细胞上非创伤性地进行染色,在亚细胞水平上观察诸如Ca 2 +、pH 、膜电位等生理信号及细胞形态的动态变化,特别是在结合了先进的生物学技术以后,更成为药理学、形态学、细胞生物学、神经科学研究中强有力的新一代研究工具。

1.1 激光扫描共聚焦显微镜的成像原理[6]

LSCM是由普通荧光显微镜和共聚焦系统组成。它采用激光作为点光源(point light source)照射标本,在焦平面上形成了一个轮廓分明的微米级的光点(light spot ) （该点正置显微镜物镜焦点所在），被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器( beam  splitter)。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔(pinhole) ,分别称为照明针孔和探测针孔。二者的几何尺寸一致,约0.1 ～0.2 μm ;相对于焦平面上的光点。二者是共轭的,即:光点通过一系列的透镜最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这正是“共聚焦”含义之所在。（如图1）

这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测针孔范围之内,而其它来自焦平面上方或下方的散射光,都被挡在探测针孔之外而不能成象。以激光逐点扫描样品,探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,转为为数字量传输至计算机, 并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。因此通过激光扫描共聚焦显微镜,可以对观察样品进行断层扫描和成像。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横断面[7]。激光扫描共聚焦显微镜现已成为活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。

经过技术改进，在激光扫描共聚焦显微镜系统中安装一个微动步进马达(最小步距可达0.1μm)来控制载物台的升降,使焦平面依次位于标本的不同层面上，则可逐层获得物体光学横断面的图像,这称为“光学切片”( Optical sectioning)。获得真正意义上的标本的三维数据,可以利用多种计算机图像处理及三维重建软件,沿x 、y 、z 轴或其它任意角度来表现标本的外形剖面,十分灵活、直观进行形态学观察。

1.2 LSCM与普通显微镜的区别

1.2.1 光源

普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。

1.2.2 空间分辨率

普通显微镜摄影是场摄影, 同时包含了焦点和非焦点的影像, 必然受到物镜分辨率和切片厚度的制约。而LSCM 对标本上的每个点都是在焦点上的摄影, 其在X- Y 轴上的最佳空间分辨率可达0.2~0.25μm, 较普通显微镜要高出40%[8];在Z 轴上的最佳空间分辨率可达0.5~0.6μm[9]。

1.2.3 瞬时分辨率[10]

LSCM 较普通显微镜的另一大优点是可以实时动态观察活体组织标本。LSCM 的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光, 即其时间分辨率极高, 能对细胞内的分子进行功能性动态观察; 检测灵敏性极强; 还可对荧光进行精确定量

1.2.4 图像处理

LSCM 的图像是以电信号的形式记录下来的, 可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图像处理。另外, LSCM 图像分析软件系统功能强大, 可对图像进行三维重建分析, 获得时空上大量多样信息, 而普通显微镜则是望尘莫及的。

2  激光扫描共聚焦显微在细胞生物学中的应用

在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性: ①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。②细胞内离子荧光标记,单标记或多标记,检测细胞内如pH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。③荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体,核酸等观察;可以在同一张样品上进行同时多重物质标记,同时观察; ④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性;数据图像可及时输出或长期储存。

激光共聚焦显微镜适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。

2.1 荧光定量定位分析[11]

经典的形态学手段如普通光学显微镜、相差显微镜及电子显微镜,仅能对肿瘤相关抗原进行定性分析,而LSCM则可对活细胞进行重复性极佳的荧光定量分析。LSCM采用定量免疫荧光对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征、抗肿瘤药物的作用及机制等方面进行定量的观察和监测,当然也是较为理想的形态学观察方法。LSCM已广泛用于癌的研究,近年来逐渐在肉瘤中得到应用。Bcl-2 作为凋亡抑制因子是年来的研究热点,但在普通光学显微镜下观察仅能显示其定位于胞浆,且只能进行定性或半定量分析,而有人用荧光标记的方法,利用LSCM 研究bcl-2 在滑膜肉瘤中的表达,对其进行了定量分析,并与正常滑膜细胞作比较,发现bcl-2 在滑膜肉瘤中的含量显著高于正常对照组,提示bcl-2 的过度表达在肉瘤的发生上起着异常重要的作用。更为重要的是其准确的亚细胞定位有利于进一步研究bcl-2 的致癌机制,并为今后基因治疗的准确定位提供了理论基础。

2.2　Ca2 + 、pH 及其他细胞内离子浓度及变化的实时定量测定

利用Fluo23 、Fura22 等荧光探针可以测量单个细胞内pH 和多种离子(Ca2 + 、K+ 、Na + 、Mg2 + ) 在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

2.3 三维重建[12]

    利用LSCM能在活体上保持标本不受损害性干扰的情况下 ,对标本作连续的光学切片,将收集到的图象经过计算机软件的分析,作出三维重建的图像,得到较为清晰的立体结构图像。利用LSCM作了正常角膜的三维重建。对角膜伤口收缩期的肌性成纤维细胞中的f -肌动蛋白结构作了三维重建,发现在角膜伤口收缩过程中,肌纤维母细胞中f -肌动蛋白的结构由无序的、随机的细点状结构到有序的、粗束状结构的变化过程。

2.4 胞间通讯研究[13]

动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。A-CAS可用于测定相邻植物或动物细胞之间细胞间通讯,测量由细胞缝隙连接介导的分子转移,研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用,以及胞内Ca2+,pH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。

2.5 粘附细胞的分选( adherent cell sorting)[14]

流式细胞仪可以实现游离细胞的分选,如鉴别出二倍体和多倍体细胞。激光细胞仪则可能对贴附在培养皿底部的粘附细胞进行分选。将细胞贴壁培养在特制培养皿上,培养皿底部有一层特殊的膜,用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状,掀去培养皿底部的膜,非选择细胞则被去除。该分选方式特别适用于选择数量极少的细胞,诸如突变细胞、转化或杂交癌细胞。另一种细胞分选的方式是用高能量激光自动杀灭不需要细胞,留下完整的活细胞亚群继续培养,这种方式适于对数量较多的细胞的选择。

2.6 细胞激光显微外科[15]

可把激光作为一把“光子刀”,实现诸如细胞膜间穿孔、线粒体或溶酶体等细胞器烧灼、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞“外科手术”。

2.7 光镊( Optical tweezer)[6]

光镊是利用激光的力学效应,将一个微米级大小的细胞器或其它结构钳制于激光束的焦平面上,也称为光陷阱(optical trap)。激光从上方进入显微镜的物镜,光束内聚,在焦平面上形成光束狭部( beam waist ) ,产生三维的光强梯度,一个微米级的物体就可被陷阱捕获。显微镜的照明光线来自下方的聚光器。光镊可以用来进行细胞融合(如卵细胞受精)、机械刺激或细胞骨架弹性测量等,特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义〔16〕,因为植物有一层厚硬的细胞壁,不能象动物细胞那样利用微操纵器对原生质膜进行机械处理。

2.8 笼锁化合物( caged compounds)的解笼锁( uncage)[14]

现在许多重要的生物活性物质(神经递质、细胞内第二信使)都有其笼锁化合物合成,如Ca 2 +的笼锁化合物主要有Nitr- 5 ,DM - nitrophen 。在笼锁(caged)状态下,其功能被封闭,一旦被特异波长(一般为紫外)的瞬间照射后,即被光活化而解笼锁( uncaged) ,快速地恢复原有的活性和功能。这种方法提供了一种在时间和空间上可控的生物活性产物或其它化合物释放的有效方法。

2.9 光漂白后的荧光恢复( Fluorescent recovery after photobleaching , FRAP)活细胞的动力学参数[12 .17]

FRAP 技术借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的未淬灭的荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。在研究细胞骨架构成、跨膜大分子迁移率、细胞膜流动性、胞间通讯等领域中有较大的意义。

2.10 长时程观察细胞迁移和生长

目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描,而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高,只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量,从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤,因此,可以用于数小时的长时程定时扫描,记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

3 激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛[18]

3.1细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡;

3.2生物化学:酶、核酸、FISH、受体分析;

3.3药理学:药物对细胞的作用及其动力学;

3.4生理学:膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态;

3.5遗传学和组胚学: 细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断;

3.6神经生物学:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递;

3.7微生物学和寄生虫学:细菌、寄生虫形态结构;

3.8病理学及病理学临床应用:活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断;

3.9生物学、免疫学、环境医学和营养学。

4 展望[1]

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学分析仪器,与传统的光学显微镜相比,大大地提高了分辨率,能得到真正具有三维清晰度的原色图象,并可探测某些低对比度或弱荧光样品,通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+,pH值,Na1+,Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标,对细胞动力学研究有着重要的意义。同时,激光扫描共聚焦显微镜可以处理活的标本,不会对标本造成物理化学特性的破坏,更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普通显微镜上的质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面,在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

 

参考文献：

[1]陈耀文，林珏龙，赖效莹，梅品超。激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。激光生物学报，1998，7（2）

[2]刘学东, 龚书明, 杨瑞华等. 第四军医大学学报,2000 , 21 (6) : 702

[3]刘运来, 姚忠祥, 蔡文琴  解剖科学进展, 1999 , 5 (4) : 367

[4]林珏龙, 陈耀文  激光生物学报, 1998 , 7(3) : 220

[5]董　明, 徐侃彦, 甄晓光 生物化学与生物物理学报, 2000 , 32 (5) :533

[6]郗昕，姜泗长，方耀云 激光扫描共聚焦显微镜的原理与生物学应用。中国体视学与图像分析。1996，12；7：74-78

[7]张旭，徐维奇。激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用。现代科学仪器。2001，2

[8]Gustafsson MG. Extended resolution fluorescence microscopy. [J].Curr. Opin. Struct. Biol., 1999;9(5): 627

[9]杨天祝,李文镇 共聚焦激光扫描显微镜术简介[J].河北医科大学学报[J].2002;23( 5) : 319

[10]许险峰,霍霞 活细胞钙动态的共聚焦扫描显微镜检测技术[J].激光生物学报.2002;11( 4) : 296

[11]周涛,杨怡,张德添,何昆,张飒 激光扫描共聚焦显微镜及其在生物医学中的应用。军事医学科学院院刊。2002，3；26（1）：69-73

[12]王风翔，何守志  激光扫描共聚焦显微镜在眼科研究中的应用。　中国体视学与图像分析。1998，3

[13]刘畅，顾玲 激光扫描共聚焦显微镜在细胞凋亡研究中的应用。医学综述，2001，7；10

[14] Klauning J E , Ruchi RJ . Role of inhibition of intercellular communication in carcinogenesis. L ab I nvest ,1990 ;62 :135 ～143

[15]Kasten FH. Introduction to fluorescent probes : properties , history and applications. In Mason WT. (ed. ) Fluorescent and luminescent probes of r biological a ctivity ; APractival Guied to Technology for Quantitative real -TimeAnalysis. New York ; Academic Press , 1993 ; 12～33

[16]陈耀文，林珏龙，陈代雄 激光扫描共聚焦显微镜三维重建花粉的组织结构。中国体视学与图像分析，1997，2；4：223-225

[17]Tyler A. Byassee, Warren C. W. Chan, and Shuming Nie。Probing Single Molecules in Single Living Cells。Anal. Chem.2000，72：5606-5611

[18]朱珊珊　黄志江  激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用   国外医学麻醉学与复苏分册　F Med Sci Anesth Resus , April 2005 ,Vol 26 ,No12